「免疫相关不良妊娠答疑解惑51」-主动免疫和封闭抗体

陈荔闽(山东省潍坊市人民医院)

刘湘源(北京大学第三医院)

朱小春(温州医科大学附属第一医院)

朱凤丽(山东菏泽牡丹区妇幼保健院)

孙曙光(辽宁省计划生育科学研究院)

冯晓芬(广西国际壮医医院)

1.封闭抗体是什么？

答：在正常孕妇的血清中，存在一种抗配偶淋巴细胞的特异性IgG抗体(通常是IgG3，有与抗原结合能力，但没有或较低毒性)，它可抑制淋巴细胞反应，封闭母体淋巴细胞对胚胎滋养层的细胞毒作用，防止辅助T细胞识别胎儿抗原的抑制物，并可阻止母亲免疫系统对胚胎的攻击。封闭同种抗原刺激的淋巴细胞产生巨噬细胞移动抑制因子，故称其为封闭抗体。

2.封闭抗体有哪些种类？临床上检测哪种封闭抗体更有意义？

答：目前发现的封闭抗体主要有以下几种：

(1)抗温B细胞抗体：为抗胎儿B淋巴细胞表面HLA-D/DR抗体;

(2)抗冷B细胞抗体：为非HLA冷B抗体;

(3)抗特异性抗体：对母体辅助T细胞表面HLA-D/DR受体的抗体;

(4)抗TLX(滋养细胞及淋巴细胞交叉反应抗原)抗体：是对绒毛及淋巴细胞共同抗原的抗体，可封闭混合淋巴细胞反应;

(5)抗Fc受体的抗体：为封闭丈夫B淋巴细胞上Fc受体的抗体;

(6)抗父体的补体依赖性抗体(APCA)。哪种封闭抗体更有临床意义尚无研究报道，临床上比较常用的是测抗丈夫淋巴细胞抗体和抗HLA-DR抗体。

3.封闭抗体是如何产生的呢？

答：机体可通过妊娠(胎儿滋养细胞脱落，进入母亲血液循环)、输血、器官移植和细菌感染所致交叉致敏等方式刺激母体产生封闭抗体。

4.如何检测封闭抗体？

答：目前检测封闭抗体的方法有单向混合淋巴细胞反应封闭试验、EA玫瑰花环抑制试验(EAI)、补体依赖的细胞毒性试验(CDC)、酶联免疫测定法(ELISA)及流式细胞术分析法等，由于补体依赖的细胞毒性试验法和酶联免疫测定法不需要特殊的仪器设备，且操作简单快速，因此被广泛应用于封闭抗体的检测。目前多数医院采用流式细胞术测定母亲抗父亲CD3、CD4、CD8、CD25的抗体，混合淋巴细胞培养及抑制试验，封闭抗体抗独特型抗体

5.用补体依赖的细胞毒性试验检测封闭抗体的优缺点？

答：(1)用丈夫活体淋巴细胞与产妇血清共同孵育，再加补体和染料，观察死亡细胞数及毒性指数，可反映患者体内补体依赖型封闭抗体的总体水平，以细胞毒性指数20%为阳性，见图1。

(2)优点：直接检测封闭效应，同时测出抗IgM和IgG型父体的补体依赖性抗体水平；

(3)缺点：操作繁琐，要求新鲜标本，假阳性和假阴性率高，检出阳性率较低(低于酶联免疫法)，仅测定HLA-Ⅰ类抗体。该方法基本被淘汰。

图1补体依赖的细胞毒性试验检测封闭抗体

6.用酶联免疫测定法检测封闭抗体的优缺点？

答：(1)将HLA抗原包被在一个孔内，将母亲血清加入孔中与孔内的HLA抗原反应，通过酶作用使其显色，见图2。(2)优点：灵敏度较高，检测的是HLA-Ⅰ和Ⅱ类抗体，操作简便，结果易读，成本低，适合于大样本检测；(3)缺点：结果不太准确，假阳性和假阴性率高。间接检测封闭效应，强阳性可间接反映有较高水平的抗独特型抗体。检测的是IgG型抗体(不包括IgM型)，包括无反应的抗体和丈夫淋巴细胞主动免疫治疗前可能存在的IgG抗体。

图2酶联免疫测定法检测封闭抗体

7.如何用混合淋巴细胞培养及抑制试验检测封闭抗体？

答：丈夫的淋巴细胞(激活细胞)与患者的淋巴细胞(反应细胞)，检测患者淋巴细胞相对刺激率(母细胞转化率，即混合淋巴细胞反应)，然后再加患者的血清(有否有封闭抗体)进行培养，计算患者淋巴细胞反应相对抑制率，检测患者血清中抗滋养细胞及淋巴细胞交叉反应抗原(TLX)抗体。见图3。

图3混合淋巴细胞培养及抑制试验检测封闭抗体

8.如何用流式细胞分析检测封闭抗体？

答：用流式细胞分析产妇血清中封闭抗体对配偶外周血T淋巴细胞CD3、CD4、CD8的封闭效率(已有妊娠或流产史的产妇应该有封闭抗体存在)。其特点是检测多个CD抗原，准确率较高(检验结果示例，见图4和图5)。

图4流式细胞仪分析封闭抗体

图5封闭抗体检测结果解读

9.封闭抗体是怎样保护胚胎的？

答：正常情况下，封闭抗体在孕初期就开始产生，至孕3个月达高峰，之后逐步降低，到分娩时又开始增高，并随着妊娠次数增加而增加(无妊娠史母亲的封闭抗体应是阴性)，存在于胎盘血、脐血和外周血中。

(1)封闭抗体与滋养细胞表面特异性抗原结合，通过阻断母儿之间免疫识别和免疫反应，从而封闭母体淋巴细胞对滋养细胞的细胞毒作用；

(2)可直接针对T或B淋巴细胞表面特异性抗原受体(BCR/TCR)，阻断有害免疫应答；

(3)通过阻断细胞毒细胞(CTL)和自然杀伤细胞(NK)等产生细胞毒性作用。

10.检测封闭抗体到底有何临床意义？

答：反复自然流产的发生可能与母体缺乏封闭抗体有关，流产次数越多的患者，其体内封闭抗体缺乏的可能性越大。患者体内缺乏抗配偶CD3、CD4、CD8抗原的封闭抗体(见图6)，母体对胎儿(半同种异体移植物)产生强烈的排斥反应，孕早期可导致反复自然流产，孕晚期则出现妊娠高血压疾病，胎儿宫内生长受限、甚至胎死宫内。

图6封闭抗体缺乏示意图

11.封闭抗体阴性是否正常？

答：封闭抗体是在妊娠早期由胚胎父源性HLA抗原刺激母体产生的胎儿保护性抗体(IgG3)，如果没有其他途径诱导产生封闭抗体，理论上非孕期应该是阴性的，怀孕后转阳。如果没有复发性不良妊娠，也不想怀孕，不需要检查封闭抗体。对于反复发生不良妊娠，迫切需要孕育一个正常孩子，夫妻双方经过系统检查除外其他明确会导致不良妊娠结局的风险因素时，孕前封闭抗体阴性考虑异常，需要针对性治疗(采用配偶淋巴细胞主动免疫)转阳后怀孕。

12.主动免疫多长时间，封闭抗体可变阳性？

答：一般情况下，女方经过3~4次主动免疫治疗后就会产生封闭抗体，少数患者没有产生封闭抗体，可以补充治疗1~2次会转阳，尽可能在封闭抗体转阳后半年内怀孕。

13.为何部分复发性不良妊娠患者封闭抗体持续阴性？

答：封闭抗体的产生与否或产生的多少，与母体免疫功能、夫妻遗传因素、主动免疫治疗操作等密切相关。如夫妻双方HLA相似位点超过2个，则用配偶的外周血提取的淋巴细胞做主动免疫治疗后，女性封闭抗体也很难转阳(没有效果)。

14.复发性不良妊娠患者只要封闭抗体阴性就需做主动免疫治疗吗？

答：不一定。对于封闭抗体阴性反复不良妊娠患者，应了解如下情况：

(1)封闭抗体确实是导致不良妊娠的原因吗？导致不良妊娠的因素很多，很多患者的病因筛查不全面，以至于最基本的抗磷脂抗体没有检查，就诊断为不明原因，直接给予主动免疫治疗，是不规范的。

(2)是否尝试过其他治疗方法？封闭抗体阴性也可通过使用环孢素和(或)免疫球蛋白治疗，可考虑做主动免疫治疗。达到成功妊娠的目的。如果这些药物治疗方法均无效，排除其它导致不孕或反复胚胎丢失的原因如子宫腺肌症导致子宫内膜容受性差，可考虑做主动免疫治疗。

15.封闭抗体、夫妻HLA相似度与淋巴细胞主动免疫之间是什么关系？

答：这是一连串相互关联的医学名词。反复不良妊娠患者如果因为封闭抗体阴性，可能需要将丈夫的外周血提取的淋巴细胞多点注射到患者前臂皮下，进行主动免疫治疗，但是否有效，需看夫妻双方HLA相似度，如果相似度较高，例如检查10个位点，有2个以上相似，则可能很难转阳(无效)，这就需要HLA不相似的第三位男士的外周血提取的淋巴细胞对女方进行主动免疫，让患者的封闭抗体尽可能转阳。

夫妻HLA相似度

16.HLA是什么？

答：HLA(HumanLeucocyteAntigen)v被称为人类白细胞抗原，具有参与抗原呈递和免疫应答等生物学作用，在器官移植、输血反应和病理妊娠中发挥重要作用。根据编码分子的特性不同，将HLA基因分为3类：HLA-I、HLA-II和HLA-III(见图7)。HLA-Ⅰ类基因分为经典和非经典I类基因，前者分为A、B和C基因，后者分为E、F和G等基因。HLA-Ⅱ类基因的六个亚区为DR、DP、DQ、DNA、DOB和DM。HLA-III类基因是人类基因组中密度最大的区域，位于I类和II类之间，编码补体有关的基因如补体C2、C4和TNF等。

图7HLA基因

17.HLA-A*0201是什么？

答：HLA-A*0201代表HLA-A座位上的0201基因。

18.哪种情况需要检测夫妻双方HLA相似度？

答：(1)超过3次以上不良妊娠，自身免疫无异常，封闭抗体持续阴性；

(2)淋巴细胞主动免疫后封闭抗体不能转阳；

(3)经药物治疗后仍无效者。

19.如下夫妻双方的HLA基因检测结果，如何解读？

答：需要把夫妻HLA相同位点的基因进行一一比对，其中HLA-DQB1*0503完全相同，而其他位点不相同，所以结果为一个相同位点。

图8HLA高分辨基因分型检测结果

20.检测夫妻双方HLA相似度的临床意义是什么？

答：夫妻间HLA相似性高被认为是导致同种免疫性复发性流产的重要因素。正常妊娠时，如果夫妇的HLA不相同，胚胎父源性HLA抗原会刺激母体的免疫系统产生抗体，这种抗体可保护胎儿不会受到母体免疫系统的攻击，就像给胎儿加了一层保护膜(封闭抗体)。如果夫妻间的HLA相似度高，超过2个位点，母体就不能产生封闭抗体，胎儿就会受到母体免疫系统攻击，将胎儿作为异物排斥，导致流产。

21.夫妻双方的HLA-I类分子相似与夫妻双方II类分子相似的临床意义一样吗？

答：临床意义不同。有研究显示：

(1)夫妻双方II类分子相似度高者多发生孕6周前的流产，因与反复流产相关的抗原主要集中在II类HLA分子(HLA-DR、DP和DQ分子)上，尤其是HLA-DR及HLA-DQA1位点上。

(2)夫妻双方I类分子(HLA-A、B和C)相似度高者多发生较晚期的流产。但需要进一步的研究证实。

22.复发性流产患者的HLA上是否有易感基因？不同人种有何不同？

答：是的，存在易感基因，且不同种族不同，现有研究提示主要存在于HLA-II类基因的DQ区和DR区。白种人群中，与复发性流产相关的易感基因是DQB1＊0501，易感单元是DQA1＊0201-DQB1＊0201、DQA1＊0101-DQB1＊0501、DQA1＊0501-DQB1＊0201；日本人群是HLA-DQB1＊1502；黄色人种(中国汉族人)复发性流产的易感基因为HLA-DQB1*0604/0605，易感单元为DQA1*01-DQB1*0604/0605。

23.夫妻HLA相似位点有6个，但不是一个省，姓也不一样，是表兄妹关系吗？

答：HLA相似位点多不一定存在血缘关系，但你们够有缘分的了。同卵(同基因)双生兄弟姐妹HLA完全相合的几率是100%，非同卵(异基因)双生或亲生兄弟姐妹HLA完全相合的几率是1/4。而人类非血缘关系的HLA相合率是1/400~10000，在较为罕见的HLA型别中，相合的几率只有几万甚至几十万分之一。

24.夫妻HLA相似位点有5个，需要第三方男士帮助来做主动免疫吗？第三方男士要查HLA相似度吗？

答：需要。夫妻双方HLA相似度高，主动免疫治疗效果差，考虑应用第三者供血进行免疫治疗。最好在治疗前也进行HLA相似度检测。

25.夫妻HLA相似度很高，生出的孩子是否像近亲结婚一样，容易生个傻子？

答：HLA是具有高度多态性的同种异体糖蛋白抗原，由人类主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)的基因簇编码，位于人类第6号染色体的短臂(6)，也就是说编码HLA的只是6号染色体上的部分DNA，因此即使HLA相似度很高，他们的基因组还是有较大的差别。目前，已证实与HLA基因型或等位基因关联的疾病包括免疫相关性疾病、某些肿瘤、感染性疾病、药物相关的不良反应等，跟下一代智力障碍无关。

26.为了避免器官排斥，器官移植需选择HLA相似度高的供体，但复发性不良妊娠夫妇的HLA相似度高，为何就会产生胚胎排斥呢？

答：(1)因为正常妊娠过程中父方的HLA抗原可以有效地刺激母体产生相应的抗体和多种有利于妊娠的细胞因子，这些保护性抗体(封闭抗体)和细胞因子能有效的保护胚胎，避免母体对胚胎的攻击。当夫妻HLA相似度高时，母体会认为是近亲繁殖，因此母体封闭抗体及其他保护性因子产生减少，攻击性因子活性增强，母体对胚胎产生排斥。

(2)关键点区别点，器官移植时常规做抗HLA抗体，该抗体是HLA-IgG，如最常见的是IgG1抗体(针对肾脏组织抗原)，则有免疫攻击作用，因此两人相似度越高，产生的抗体越低，不易排异。但妊娠时产生的封闭抗体是IgG3(是针对胎儿父亲HLA抗原)，该抗体有结合能力，起封闭作用，但低免疫攻击作用，因此越高越好。

同种免疫异常

27.什么是同种免疫异常？

答：是母胎间免疫平衡失调引起的、母体免疫系统攻击组织不相容的胚胎组织。

28.同种免疫异常与自身免疫有何不同？

答：母体内产生自身抗体(包括非器官特异性抗体如抗核抗体、抗磷脂抗体、器官特异性抗体如抗生殖细胞抗体、抗甲状腺抗体，及ABO血型抗体等)攻击母亲自身组织，导致自身组织损伤如胎盘血栓形成，叫自身免疫。而母胎间免疫平衡失调(包括封闭抗体产生不足、HLA-G表达减少、Th1/Th2失调、Treg/Th17失调、巨噬细胞、树突状细胞和补体异常激活等)引起的、母体免疫系统攻击组织不相容的胎儿半同种异体移植物，叫同种免疫。简单地说，自身免疫是母亲免疫系统攻击母亲自已，同种免疫是母亲免疫系统攻击胎儿。

29.如何诊断同种免疫型不良妊娠？

答：同种免疫型不良妊娠的发病机制非常复杂，同种免疫反应的部位主要局限在母胎界面，即局部免疫反应，因这个部位无法取到组织进行检查，所以很难做出精准诊断。以往认为同种免疫型不良妊娠是排除性诊断，需要排除导致不良妊娠的所有其他因素，包括胚胎染色体异常、内分泌异常、生殖器官解剖畸形、生殖道感染、自身免疫系统异常和血栓前状态/易栓症等，但实际上很难排除。我们的研究发现，这些因素往往同时存在，很少单一因素致病，因此，如果复发性不良妊娠患者的封闭抗体持续阴性，且无法用其他原因来解释，就应该考虑同种免疫型不良妊娠。

30.同种免疫型不良妊娠有哪些治疗措施？

答：(1)小剂量激素+环孢素(他克莫司或硫唑嘌呤),可配合其他药；

(2)免疫球蛋白；

(3)淋巴细胞主动免疫。

主动免疫

31.何为淋巴细胞主动免疫治疗？

答：主动免疫治疗，即淋巴细胞免疫治疗(lymphocyteimmunotherapy，LIT)，是使用丈夫或(和)第三方淋巴细胞免疫原注射，刺激母体产生抗丈夫淋巴细胞HLA抗原的抗体。通常该抗体是IgG3，具有与抗原结合能力，但没有对抗原攻击作用，所以是一种保护性抗体，叫做封闭抗体。免疫治疗是激活了体内的细胞因子，尤其是Th2型细胞因子，更强调免疫治疗后患者细胞因子的改变。

32.主动免疫的作用机制是什么？

答：(1)诱导封闭抗体产生；

(2)促使Th1/Th2细胞因子平衡向Th2偏移，包括外周血和蜕膜局部；

(3)调节T淋巴细胞亚群比例，包括CD4/CD8比例、Th17/Treg，αβT/γδT等；

(4)下调NK细胞活性；(5)纠正共刺激分子CD80、CD86表达异常。

33.封闭抗体阴性，到底是否应该做主动免疫呢？

答：(1)目前存在两种截然不同的说法，一种是没必要做，因封闭抗体阴性的女性比例居多，大约占90%，很多女性即使是封闭抗体阴性也能顺利怀孕产子，且治疗还有一定的危险性。另一种就是做封闭抗体很有必要，且治愈率可达80%以上。如果是连续自然流产，而封闭抗体又为阴性的话则必须进行治疗，因为封闭抗体阴性很可能就是反复流产的原因。

(2)有研究显示，对已经排除各种明确致病因素，考虑存在同种免疫功能紊乱的早期复发性流产有一定疗效，尤其是NK细胞数量及活性升高者。后期荟萃分析发现，主动免疫治疗对原发性复发性流产(病人从来没有过足月分娩史)有效，对继发性复发性流产更推荐用免疫球蛋白，抗核抗体和抗甲状腺球蛋白抗体阳性的患者进行主动免疫，再次妊娠失败的风险大。

(3)我们认为，主动免疫治疗不是治疗封闭抗体阴性的同种免疫异常患者的首选，考虑到做主动免疫治疗比较繁琐，没有统一规范，疗程比较长，有一定风险，且有其他药物如丙种球蛋白等可替代，只有在使用泼尼松、环孢素、他克莫司、丙种免疫球蛋白等治疗失败的难治性同种免疫异常型患者比较适用。